domingo, 2 de diciembre de 2012

MONOGRAFÍAS: Criopreservación de células madre. Conceptos

Artículo realizado por Javier Hernando Bugella (Licenciado en Biología):


Antes de realizar el trasplante de médula a un paciente, bien con sus propias células (trasplante autólogo), o con una médula compatible (trasplante alogénico), el proceso de protección con crioprotectores es esencial, para dejar preparada la muestra a una concentración celular conocida y en unas condiciones biológicamente correctas que garanticen su almacenamiento durante el tiempo que sea necesario, sin pérdida de sus capacidades de autorregenaración y diferenciación. El método más idóneo para alcanzar este objetivo es la criopreservación, cuyos fundamentos teóricos y prácticos describiremos a continuación:




TEORIA DEL DAÑO POR CONGELACIÓN

La congelación de una suspensión celular tal como la médula ósea o las “stem cells” de sangre periférica o la sangre de cordón umbilical, implica esencialmente un cambio de fase, es decir, la transformación de un sistema líquido en otro sólido. Durante este proceso tienen lugar dos fenómenos que pueden ocasionar un daño celular irreversible: la deshidratación osmótica y la formación de cristales de hielo intracelular.

Cuando una solución salina isotónica se somete a un descenso de temperatura por debajo de su punto crioscópico, comienza a formarse un cristal de hielo de crecimiento progresivo que contiene únicamente agua. Conforme desciende la temperatura, se produce una paulatina incorporación de moléculas de agua al núcleo de hielo, dando lugar a un incremento en la concentración de solutos presentes en el resto del líquido. De esta manera, al llegar a -21,1oC, la solución salina adquiere una concentración de 5,2 mol/L, alcanzando el llamado  punto eutéctico, en el cual se produce la solidificación de resto de la muestra.

Al congelar una suspensión de células, la formación de hielo comienza en el líquido extracelular, debido a que en él existe un mayor intercambio de calor con el medio circundante y alcanza más rápidamente el equilibrio térmico con  la cámara de congelación. De este modo, la concentración de solutos extracelulares aumenta paulatinamente, originando un gradiente osmótico que provoca la salida de agua de la célula, con la consiguiente deshidratación intracelular, lesión de la membrana y lisis celular. Este hecho acontece preferentemente cuando el ritmo de enfriamiento es excesivamente lento.

El rango de tolerancia osmótica varía ampliamente de unas células a otras. Los linfocitos, precursores hematopoyéticos (CFUs) y monocitos de encuentran entre los de mayor tolerancia, mientras que los hematíes y especialmente los granulocitos, muestran una escasa resistencia a soluciones hiperosmolares.

Si el proceso de enfriamiento se produce a un ritmo excesivamente rápido, no hay tiempo para que el agua intracelular difunda hacia el exterior, por lo que el sistema se alejará del equilibrio, quedando el medio intracelular menos concentrado que el extracelular. Esto da lugar a la formación de cristales de hielo en el interior de la célula, lo que origina una lesión mecánica de los orgánulos celulares.



CRIOPROTECTORES COLIGATIVOS

El agente crioprotector más ampliamente utilizado en la criopreservación de médula ósea es el dimetilsulfóxido (DMSO), aunque se han empleado otros tales como el glicerol, hidroxietilalmidón (HES) y polivinilpirrolidona (PVP).

Entre sus propiedades más conocidas está la de actuar como sustancia coligativa, incorporando moléculas de agua y ralentizando el crecimiento de los cristales de hielo, lo que evita un aumento brusco de la concentración de solutos extracelulares. Por otra parte, la capacidad del crioprotector para penetrar en la célula aumenta la concentración del medio intracelular previniendo la formación de cristales intracelulares y evitando así la posible pérdida de viabilidad.

Tanto las soluciones de DMSO como las de glicerol sufren un incremento de viscosidad conforme desciende la temperatura y aumenta su concentración, siendo esta peculiaridad uno de los mecanismos que hacen decrecer la velocidad de formación de hielo.

De este modo, la adición de una sustancia crioprotectora permite emplear un ritmo de enfriamiento tal que no se pierda tanto líquido intracelular como para causar deshidratación, pero manteniendo al mismo tiempo una concentración de solutos intracelulares suficientes como para minimizar la aparición de cristales en el interior de la célula.




DINÁMICA DE LA CRIOPRESERVACIÓN

Uno de los momentos críticos de la criopreservación de cualquier espécimen biológico es la denominada “fase de transición”, o periodo durante el cual el sistema pasa de fase líquida a fase sólida. En ese momento, el agua de la solución libera el calor latente de fusión para transformarse en un medio sólido. Si el programa de congelación no reacciona a tiempo, el ritmo de enfriamiento disminuye y la curva de descenso de temperatura se ralentiza, lo que expone a las células a los efectos del elevado gradiente de presión osmótica. Clásicamente se ha admitido que el daño celular así originado, sería directamente proporcional a la duración de la fase de transición.

La mayoría de los centros emplean programas que incluyen un descenso profundo y sincronizado de la temperatura de la cámara para contrarrestar la liberación del calor de fusión.

Una vez iniciado el cambio de estado, el ritmo de enfriamiento debe mantenerse constante, entre 1o y 2o C/min, para evitar un posible sobreenfriamiento de la célula.




CONGELADORES PROGRAMABLES

Existen en el mercado diversos aparatos de criopreservación (Cryoson BV10, Planner Kryo 10) que permiten establecer un programa en el que se definen distintos segmentos o rampas de descenso de temperatura. Todos ellos constan de los siguientes elementos:


  • Cámara de congelación, debidamente aislada, en la que se colocan las muestras que van a ser sometidas a criopreservación.
  • Sistema de aporte de nitrógeno líquido, consistente en un recipiente presurizado adaptado a una válvula electromecánica, que introduce gas nitrógeno en la cámara de congelación.
  • Uno o varios termopares (figura) destinados a la medición constante de la temperatura real, tanto en la cámara como en la propia muestra u otro espécimen usado como testigo.
  • Un módulo de programación y control que permite establecer los programas, dirigir su ejecución y analizar los datos provenientes de la cámara.
  • Un sistema de registro gráfico o alfanumérico que refleja la curva de congelación obtenida.





PRINCIPIOS GENERALES DE LA TÉCNICA


Los principales factores a tener en cuenta en el procedimiento de criopreservación son la suspensión celular, el medio de congelación, el programa a seguir y el sistema de almacenamiento

La suspensión celular de la que partiremos será una muestra de médula ósea, o “stem cells” de sangre periférica, sometida previamente a uno de los métodos de procesamiento. Por lo tanto tendremos una suspensión de células hematopoyéticas nucleadas con un número variable de hematíes contaminantes. Si se ha efectuado una separación en gradiente de densidad, la muestra será una población purificada de células mononucleadas. En cualquier caso, es importante que la concentración final de células no exceda de 2 – 3 *10exp7 cél/ml. 

El medio de congelación o solución criopreservante puede variar, pero es recomendable que contenga una fuente de aporte de proteínas que puede ser albúmina humana o suero o plasma autólogos u homólogos, en una concentración final de al menos el 10%, diluido en un medio de cultivo del tipo TC199. Algunos grupos emplean suero como único medio, constituyendo éste el 90% del volumen final de la muestra. El agente crioprotector de elección es el DMSO, debiendo ajustarse a una concentración final del 10%. 

La adición del crioprotector debe hacerse lentamente y con la muestra a 4ºC. Para ello se procederá a preparar un volumen de células+medio, sobre el cual se añadirá lentamente otro volumen de medio+DMSO al 20%, de forma que la concentración final de crioprotector sea del 10%. 

Una vez terminada la mezcla, de transferirá a una bolsa de congelación que debe estar constituida por un material plástico no lipofílico para evitar el daño a las membranas celulares, y además ser lo suficientemente resistente a bajas temperaturas (-196 ºC). La bolsa debe introducirse en una carcasa de aluminio que mantendrá comprimidas ambas superficies, dando así un espesor homogéneo a la muestra que facilite un correcto intercambio de calor. 

El programa de congelación puede variar, pero en líneas generales debe incluir primero una fase de estabilización a 4 ºC, seguida de un descenso constante de temperatura a un ritmo de 1 o 2 ºC /min. En el momento previsto del “cambio de fase”, debe inducirse un descenso acusado de la temperatura de la cámara, para compensar la liberación del calor de fusión e inducir el proceso de nucleación. Una vez superada la fase de transición, el ritmo de enfriamiento debe permanecer constante entre 1 o y 2 ºC /min. 

La médula congelada debe almacenarse en un contenedor de nitrógeno líquido, preferentemente inmerso en la fase líquida, donde la temperatura se mantiene constante a -196 ºC. Si la muestra se sitúa en la fase gaseosa, la temperatura puede experimentar oscilaciones entre 100 y 140 ºC, debido a las repetidas aperturas del tanque contenedor, lo que no es recomendable.




BIBLIOGRAFÍA

Cryopreservation of tissue and solid organs for transplantation. Glassman AB and Umlas J, eds. AABB, 1983.

Collection, manipulation and freezing of haemopoietic stem cells. Gorin NC. Clin. Haematol. 15 (1): 19-48. 1986.

Prevention of freezing damage to living cells by dimethil sulfoxide. Lovelock JE, Bishop MWH. Nature 183:1394.

Cryopreservation of human bone marrow cells by a modification of the two step cooling technique. Berthier R, Kaufman A, Schweitzer A, Thevenon D, Hollard D: Cryobiology 20: 637 . 1983.

3 comentarios:

  1. ?Que sabe Usted de remisión de cancer de diversos tipos con celulas madres autologas, que se reportó con exito en el Uruguay?Este medico compartió datos con colegas en Espana

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  2. Hola, es recomendable usar DMSO mas DEXTRAN como mezcla de congelacion? Crioprotector interno y Crioprotector externo! En que concentracion final se utilizarian?

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    1. Te remito dos enlaces:
      http://biolifesolutions.com/cell-therapy/freeze-media/umbilical-cord-blood-cryopreservation/
      http://www.scielo.org.co/pdf/rcog/v57n4/v57n4a08.pdf

      Espero te sirva

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