viernes, 15 de julio de 2016

Una combinación de cuatro genes convierte células de la piel en progenitores eritroides

Fuente: http://revistageneticamedica.com/2016/07/05/reprogramacion-celular-piel-eritrocitos/

Sandra Capellera-Garcia y Johan Flygare
Department of Molecular Medicine and Gene Therapy, Lund Stem Cell Center, Lund University, Sweden

Los eritrocitos, en rojo, son las células sanguíneas más numerosas, encargadas de transportar oxígeno y facilitar el intercambio de gases en los pulmones y tejidos periféricos.





Los eritrocitos, también llamados glóbulos rojos o hematíes, son las células sanguíneas más numerosas y se encargan de transportar oxígeno y facilitar el intercambio de gases en los pulmones y tejidos periféricos. Hace ya más de un siglo se observó que los eritrocitos de los mamíferos no poseen núcleo, mientras que los glóbulos rojos de las aves, anfibios y peces retienen el núcleo durante toda su vida en circulación (Gulliver, 1875). En 1908, gracias al estudio de embriones de mamífero, se descubrió que existen dos poblaciones distintas de células eritroides que se solapan en el tiempo. La primera población consiste en células grandes y nucleadas que circulan de forma temporal durante las primeras fases del desarrollo embrionario, mientras que la segunda población consiste en células más pequeñas y sin núcleo que circulan durante la vida fetal y postnatal (Maximow, 1909; Palis, 2014).


En humanos, el 84% del número total de células en el cuerpo son eritrocitos (Sender, 2016). Un adulto sano produce aproximadamente dos millones de glóbulos rojos cada segundo a través de un proceso llamado eritropoyesis. El modelo clásico de eritropoyesis en mamíferos empieza en las células madre hematopoyéticas (células multipotentes que pueden generar todos los tipos celulares de la sangre), y continúa con el desarrollo de una serie de progenitores y precursores eritroides, que al final se diferencian y dan lugar a eritrocitos maduros (Sankaran and Weiss, 2015). Este proceso está estrechamente regulado por señales intrínsecas y extrínsecas. El factor extrínseco más importante para la clínica es la hormona eritropoyetina o EPO, que se usa extensamente como medicamento para tratar la anemia, pero también de forma ilícita en el deporte como método de dopaje. Entre las señales intrínsecas se encuentran los microARNs y las proteínas que modulan el proceso de transcripción (factores de transcripción). Casi todo lo que sabemos hoy sobre los genes y proteínas que regulan la eritropoyesis es gracias al estudio de enfermedades en las cuales la producción de eritrocitos es ineficaz, o a modelos animales donde un gen está ausente. Estos estudios han servido para identificar genes que, cuando están mutados o ausentes, causan una alteración del desarrollo y/o de la diferenciación del linaje eritroide (Cantor, 2002). Sin embargo, no nos indican cuál de estos genes son realmente necesarios para iniciar el proceso de producción de eritrocitos.


Nuestro grupo ha dado respuesta a esta pregunta, es decir, ha identificado el conjunto mínimo de genes necesario para activar el programa genético de producción de glóbulos rojos. Para ello, hemos utilizado un método llamado reprogramación celular, que consiste en cambiar el potencial de desarrollo de una célula eliminando y remodelando marcas epigenéticas (por ejemplo, metilación del ADN) en su genoma. Este proceso ocurre de manera natural en un cigoto recién fertilizado, donde los genomas materno y paterno son desmetilados y remetilados para asegurar que el embrión podrá formar un individuo completo. No obstante, también puede ser inducido artificialmente mediante la introducción de factores exógenos (normalmente factores de transcripción) en el genoma. Este último método fue descubierto por el Dr. Shinya Yamanaka en 2006, cuando demostró que células especializadas (por ejemplo, células de la piel) podían ser reprogramadas para convertirse en células madre embrionarias mediante la introducción de cuatro factores de transcripción[1] (Takahashi and Yamanaka, 2006). Este revolucionario descubrimiento animó a muchos investigadores a buscar combinaciones de genes que pudieran transformar células de la piel en diferentes tipos celulares con valor médico, como neuronas, cardiomiocitos y hepatocitos (Cohen, 2011). Además de ofrecer un nuevo método para generar diferentes tipos de células con potencial biomédico, la reprogramación celular también es útil para encontrar los genes esenciales que establecen la identidad de una célula especializada.



Capellera-Garcia et al. demuestran que la expresión de Gata1, Tal1, Lmo2 y c-Myc (GTLM) convierte células de la piel de mamífero directamente en progenitores eritroides. Una de las características más relevantes de este proceso de reprogramación celular es la acumulación de hemoglobina, proteína responsable de transportar oxígeno y de dar el color rojo a la sangre. Aquí, este proceso es simbólicamente representado por la conversión de agua en vino. Ilustración de Sandra Capellera-Garcia.




En nuestro trabajo recién publicado en Cell Reports, demostramos que la expresión de sólo cuatro genes (de los más de 20.000 que constituyen el genoma humano) es suficiente para reprogramar células de la piel de mamífero directamente en progenitores eritroides (Capellera-Garcia, 2016). Para llevar a cabo el estudio, utilizamos un modelo de ratón en el que sólo los eritrocitos y sus progenitores están marcados con una proteína amarilla fluorescente. Establecimos cultivos de células de la piel a partir de las colas de estos ratones y les introdujimos diferentes combinaciones de entre más de 60 genes candidatos mediante retrovirus[2]. Gracias al sistema de la proteína amarilla fluorescente, pudimos distinguir qué células activaban el programa genético para producir eritrocitos (y por tanto eran amarillas) y cuales no (no eran amarillas). Después de un intenso cribado, identificamos cuatro genes (Gata1, Tal1, Lmo2 y c-Myc) que, en sólo ocho días, podían convertir células de la piel directamente en progenitores eritroides. Notoriamente, cuando uno de estos cuatro genes era excluido de la mezcla, las células de la piel no se reprogramaban, lo cual sugiere que los cuatro son necesarios para la conversión. Posteriormente demostramos que las células reprogramadas, que llamamos iEPs (por las siglas en inglés, induced Erythroid Progenitors/Precursors), poseían características típicas de células eritroides: tenían un tamaño y forma similar, expresaban genes asociados con las funciones de los glóbulos rojos y acumulaban hemoglobina, la proteína responsable de transportar oxígeno y de dar el color rojo a la sangre. Las iEPs también formaron colonias rojas cuando las sometimos a cultivos clonogénicos, lo cual demuestra la presencia de progenitores eritroides.


Seguidamente quisimos conocer más detalladamente las diferencias en expresión génica (analizando el ARN en las células) entre iEPs y progenitores eritroides normales de ratón. Para ello, utilizamos un chip de ADN, técnica que permite identificar y cuantificar todos los ARNs en una población de células. Detectamos que las iEPs expresaban altos niveles de hemoglobinas embrionarias, mientras que los progenitores eritroides normales (que se encuentran en la médula ósea en ratones adultos) solamente expresaban hemoglobinas adultas. Esta observación apuntaba a que las iEPs eran, de hecho, más parecidas a los eritrocitos que aparecen durante el desarrollo embrionario en el saco vitelino[3] que a los eritrocitos que se encuentran en la sangre del ratón adulto.


El siguiente paso del estudio consistió en encontrar genes adicionales que pudieran aumentar la expresión de las hemoglobinas adultas en detrimento de las hemoglobinas embrionarias. Este hallazgo mejoraría el potencial clínico de las iEPs, ya que serían más similares a los eritrocitos adultos. En un segundo cribado, identificamos dos genes más, Klf1 y Myb, que redujeron la expresión de las hemoglobinas embrionarias e incrementaron la expresión de las hemoglobinas adultas, haciendo de estas últimas el tipo predominante en iEPs.


Finalmente, evaluamos si los resultados obtenidos en células de ratón también eran aplicables a células humanas. La introducción de la misma combinación de genes (Gata1, Tal1, Lmo2 y c-Myc) en células de la piel humanas convirtió éstas en progenitores eritroides en doce días, reproduciendo los resultados obtenidos en células de ratón. Ésta fue una observación relevante, ya que indica que Gata1, Tal1, Lmo2 y c-Myc constituyen un programa genético para generar eritrocitos que está conservado en mamíferos.


En resumen, creemos que nuestros resultados pueden constituir un modelo para estudiar los programas genéticos que controlan el desarrollo del linaje eritroide. Asimismo, podrían utilizarse como un nuevo método para estimular la diferenciación de células madre embrionarias hacia el linaje eritroide y/o para producir glóbulos rojos a partir de células de la piel de pacientes para transfusiones de sangre personalizadas.




[1] Este descubrimiento le valió el premio Nobel de Medicina en 2012 junto a Sir John B. Gurdon.


[2] Los retrovirus tienen la capacidad de integrarse de manera estable en el genoma de la célula huésped.


[3] Los eritrocitos del embrión y los del adulto expresan diferentes tipos de hemoglobina. Las hemoglobinas embrionarias tienen una afinidad mayor por el oxígeno que las hemoglobinas adultas, lo cual permite que el feto extraiga el oxígeno más eficientemente de la circulación materna.




Referencia:

Capellera-Garcia S, et al. Defining the minimal factors required for erythropoiesis through direct lineage conversion. Cell Rep. 2016 Jun 14;15(11):2550-62. Doi: 10.1016/j.celrep.2016.05.027





Bibliografía:


Cantor AB and Orkin SH. Transcriptional regulation of erythropoiesis: an affair involving multiple partners. Oncogene. 2002 May 13;21(21):3368-76. Doi: 10.1038/sj/onc/1205326


Cohen DE and Melton D. Turning straw into gold: directing cell fate for regenerative medicine. Nat Rev Genet. 2011 Apr;12(4):243-52. Doi: 10.1038/nrg2938


Gulliver G. Observations on the sizes and shapes of red corpuscles of the blood of vertebrates, with drawings of them to a uniform scale, and extended and revised tables of measurements. Proc. Zool. Soc. Lond. 1875, 474–495


Maximow AA. Untersuchungen uber blut und bindegewebe 1. Die fruhesten entwicklungsstadien der blut- und binde- gewebszellan bein saugetierembryo, bis zum anfang der blutbilding unden leber. Arch. Mikroskop. Anat. 1908, 73:444


Palis J. Primitive and definitive erythropoiesis in mammals. Front Physiol. 2014 Jan 28;5:3. Doi: 10.3389/fphys.2014.00003


Sankaran VG and Weiss MJ. Anemia: progress in molecular mechanisms and therapies. Nat Med. 2015 Mar;21(3):221-30. Doi: 10.1038/nm.3814


Sender R, et al. Are we really vastly outnumbered? Revisiting the ratio of bacterial to host cells in humans. Cell 2016 Jan 28;164(3):337-40. Doi: 10.1038/nm.3814


Takahashi K and Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006;126:663–676. Doi: 10.1016/j.cell.2006.07.024

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